腺苷是核酸代謝途徑中的主要因子之一,是酶反應和細胞修復所需要輔助因子的組成部分,具有廣泛的生理和藥理作用。其生產意義主要有:(1)臨床用藥,治療心律不齊、風濕性心臟病,心肌炎等;(2)抗病毒、腫瘤,以及ATP、CoA等多種藥用核苷酸類物質的前體。目前國內腺苷生產嚴重不足,而且用的是生產成本很高的化學法或酶法。發(fā)酵法生產腺苷的研究有利于生產成本的降低[2]。枯草桿菌內核酸的合成代謝途徑如圖1:
圖1 枯草桿菌嘌呤核苷酸合成途徑
1.PRPP 轉酰胺酶；2. IMP環(huán)化脫水酶；3. SAMP合成酶；4.SAMP裂解酶；5.AMP脫氫酶；
6. IMP脫氫酶；7.XMP 氨化酶；8.GMP還原酶；
由上圖可看出由于Ｂ.subtilis 中存在酶5和酶8使得通常的核苷酸分枝合成途徑成為環(huán)形途徑,同時AMP和ATP等對酶1和酶3有強烈的反饋抑制作用,因此在正常情況下雖有酶9,但菌內的AR含量及濃度均很低。而在使酶6缺陷后,如又能解決反饋抑制,則AR的生成將有顯著提高。十六烷基三甲基溴化銨能改善細胞的滲透性,有利于AR的及時分泌,使胞內的AMP濃度下降,不失為解決反饋抑制的一個可行途徑。
1材料與方法
1.1 菌株
腺苷產生株Ｂ. Subtilis 黃嘌呤缺陷型。
1.2 培養(yǎng)基
葡萄糖, 1.0;
酵母粉, 1.0;
蛋白胨, 0.4;
牛肉膏, 1.4;
瓊脂, 1.8;
pH 7.0
葡萄糖, 2.0;
酵母粉, 1.5;
蛋白胨, 1.0;
玉米漿, 1.0;
尿素, 0.3;
NaCl, 0.25;
pH 7.0
尿素,0.375;KH2PO4,0.5;NH4Cl,2.0;酵母粉,3.0;玉米漿,3.0;CaCO3,2.0;葡萄糖,10.0;MgSO4·7H2O,2.0(分消);pH6.6。
1.3 主要化學試劑
十六烷基三甲基溴化銨(上海伯奧生物科技有限公司)
1.4 分析方法
用751型分光光度計,測定培養(yǎng)液OD580ｎｍ的光密度(稀釋5倍)
精密pH試紙(5.5～9.0)
吸10μL發(fā)酵上清液點樣,上行走紙層析3h。剪下最前面一個紫外吸收斑點,用4ml0.01mol/LHCl
2結果與討論
2.1 搖瓶發(fā)酵
據(jù)報道,枯草芽孢桿菌在500ml搖瓶內置20ml發(fā)酵培養(yǎng)基,往返式搖床120ｒ/min,溫度
圖2 腺苷產率、糖濃度、菌密度與發(fā)酵時間關系
2.2 添加CTAB的時間對AR產率的影響
圖3 添 加時間對產率的影響
我們使用的枯草芽孢桿菌黃嘌呤缺陷型菌株經(jīng)多次純化后,對表面活性劑敏感。在4%CTAB下,試驗時間范圍是12～84ｈ,得最佳添加時間為發(fā)酵60ｈ左右。
2.3 添加CTAB的量對產率的影響
試驗范圍2.0%～6.0%,得CTAB最佳添加量為4.0%。
圖4 添加量對產率的影響
2.4 添加Tween60對CTAB的輔佐作用
CTAB會使發(fā)酵過程中產生大量泡沫,在4%CTAB時考察消泡劑Tween60的作用,結果顯示在1%時對產率稍有提高。
圖5 Tween60對產率的影響
CTAB是一種陽離子表面活性劑,其陽離子屬堿性基團,而革蘭氏陽性菌細胞壁表面酸性基團多于堿性基團,因此CTAB對枯草桿菌這種革蘭氏陽性菌有很強的吸附作用。表面活性劑結構中都具有疏水性基團和親水性基團,當CTAB透過細胞壁后,其疏水性基團十六烷基能與細胞膜中的脂質結合,而其親水性的陽離子可與膜中的蛋白質結合,從而增加膜的流動性。值得注意的是ＡＲ具有使細胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性及膜的流動性降低的生理作用,因此增加膜的流動性就顯得更具意義了。
Ｂ.subtilis 黃嘌呤缺陷型菌株在接種后要經(jīng)過一個較長的誘導期,約18ｈ,由于表面活性劑對細胞壁和細胞膜有損傷作用,而細胞壁與細胞膜的完整性對細胞分裂有重要影響,因此誘導期加入CTAB將會使對數(shù)增殖期的前體細胞不足,從而導致穩(wěn)定期菌數(shù)的嚴重不足,使產率降低。在對數(shù)增殖期(18～48ｈ)加入CTAB會直接抑制細菌的增殖,如在該期的前期加入,也會引起穩(wěn)定期菌數(shù)的不足,影響產率,如在該期的后期加入CTAB,由于已有相當規(guī)模的菌數(shù),仍可輕度的提高產率,當處于穩(wěn)定期后,細胞數(shù)保持恒定,該期是合成目的產物的旺盛時期,此時加入CTAB能使ＡＲ快速移至胞外,反饋抑制得以緩解;而到了衰退期再加CTAB就顯得意義不大了。
由于表面活性劑是一類對細胞有損傷作用的物質,CTAB能使膜中的蛋白質變性,在量大時季銨鹽具有殺菌的作用,因此發(fā)酵中須選擇最佳的添加量。
在添加CTAB后,發(fā)酵過程中會產生大量的泡沫,這會影響通氣量,而氧溶量是發(fā)酵成功的一個關鍵因素,如同時添加適量的消泡劑Tween60可有效控制泡沫的產生,但由于Tween60本身也是個對細胞膜有一定損傷作用的物質,因此CTAB和Tween60的相對用量也必須作出選擇,當Tween60用量超過2%時,就會降低AR的產率。
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