1 引 言
研究氧化還原蛋白質(zhì)與電極之間的電子傳遞過程具有重要意義。一方面它為理解生物電化學(xué)和生物代謝過程提供有價(jià)值的信息,另一方面,利用電極探討氧化還原蛋白質(zhì)與底物分子之間的電子傳遞過程,為制備生物傳感器提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
HRP含有輔基血紅素,它是研究過氧化物酶的結(jié)構(gòu)､動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)的代表。另外,HRP修飾電極廣泛運(yùn)用于分析過氧化氫､有機(jī)過氧化物､酚類化合物､芳香化合物以及一些環(huán)境污染物。近幾年,利用各種材料的電極對(duì)HRP的直接電子傳遞過程及催化性能進(jìn)行了深入的研究,但HRP修飾電極的催化電子傳遞機(jī)理仍存在著爭(zhēng)議。而且只有少數(shù)文獻(xiàn)描述了酶中Fe(Ⅲ)/FeⅡ氧化還原對(duì)的電化學(xué)行為。原因是HRP中的電活性中心與電極之間的電子傳遞速度很慢。因此,研究酶的固定化材料和方法､使酶具有適宜的環(huán)境､保持其活性､具有良好的取向以加速電子傳遞過程是當(dāng)前十分活躍的研究課題。表面活性劑膜具有與生物體磷酯膜十分近似的結(jié)構(gòu)。因而可能成為研究蛋白質(zhì)的電化學(xué)提供良好的微環(huán)境,為構(gòu)造生物傳感器提供新型材料。
本文研究了在表面活性劑膜內(nèi)的HRP的電化學(xué)性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:(1)表面活性劑是一種固定酶的理想材料;(2)這種體系可能構(gòu)造第三代生物傳感器。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 試劑和儀器
HRP(Grade Ⅱ,德國Boehringer公司),使用時(shí)未經(jīng)提純。雙十二碳烯基溴化二甲基銨(DDAB,Aldrich公司),雙十四酰基磷酯酰膽堿(DMPC,Sigma公司),雙十六烷基磷酸(DHP,Fluka公司)。其它化學(xué)試劑均為分析純,所有溶液用Milli-Q水配制而成。緩沖溶液(離子強(qiáng)度為0.1)配制:酒石酸鹽pH3.0～6.0;磷酸鹽pH7.0～8.0;硼砂pH=9.0～10.0;磷酸鹽:pH=11.0。電化學(xué)測(cè)量使用計(jì)算機(jī)控制的Autolab電化學(xué)系統(tǒng)(荷蘭Eco.Chemie公司)。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 電極的修飾 表面活性劑DDAB(10mmol/L),DMPC(10mmol/L)和DHP(2.5mmol/L)的懸濁液,超聲波振蕩形成分散液。等體積的表面活性劑分散液和HRP(165g/L)的磷酸鹽溶液混合。取10μL該混合液平鋪于電極表面,空氣干燥約12h。制得的修飾電極分別表示為:DDAB/HRP,DMPC/HRP,DHP/HRP。
2.2.2 電化學(xué)測(cè)量 電化學(xué)池由參比電極池和電化學(xué)反應(yīng)池(體積約400μL)兩部分構(gòu)成,其間由魯金(Lugging)毛細(xì)管連接。參比電極為飽和甘汞電極(vs.SCEK401,Radiometer)。鉑絲網(wǎng)為輔助電極,工作電極為EPG(LeCarbone-Lorraine),電化學(xué)面積由Randles-Sevocik方程求得為0.075cm2。每次實(shí)驗(yàn)前,EPG電極用金相砂紙磨平,在人造毛絨上以Al2O3(粒度0.015μm,BDH)懸濁液拋光成鏡面。超聲波震蕩清洗后,進(jìn)行電極修飾。實(shí)驗(yàn)過程中在支持電解質(zhì)溶液中通N2除O2。
3 結(jié)果及討論
3.1 辣根過氧化物酶的直接電化學(xué)
DDAB/HRP,DMPC/HRP,DHP/HRP膜修飾電極于磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中測(cè)得的CV曲線為圖1所示。
圖1 酶修飾電極的循環(huán)伏安圖
均呈現(xiàn)一對(duì)氧化還原峰。峰的形狀基本對(duì)稱而且氧化和還原峰高大致相等。而不含HRP的表面活性劑膜電極不產(chǎn)生法拉第電流。所以此氧化還原峰是HRP的電活性中心與電極之間進(jìn)行電子交換的結(jié)果。
半波電位(表1)與用電勢(shì)法測(cè)定HRP血紅素Fe(Ⅲ)/FeⅡ氧化還原對(duì)的電位值(E=-0.271V,PBSpH7.0,T=30℃)相近。
隨著掃描速度的增加,陽極峰與陰極峰的電位差值(ΔEp)有微小的改變。ΔEp大于表面過程的理論值(ΔEp=0mV)。這種結(jié)果的產(chǎn)生可以歸于HRP的構(gòu)象效應(yīng)。即:HRP分子較大且形狀不太規(guī)則,電活性點(diǎn)埋藏較深。另外電場(chǎng)力的影響,導(dǎo)致在電位掃描過程中,引起電荷分布和空間位置的變化,使ΔEp偏離理論的估算值。但當(dāng)掃描速度高于1V/s時(shí),其峰電流與掃描速度成正比例,線性方程分別為:陰極峰電流:y=-0.779+9.687x,r=0.9837;陽極峰電流:y=-0.642+9 628x,r=0.9739。表明該電化學(xué)反應(yīng)為吸附在電極表面的HRP與電極之間的電子交換過程。
在較寬的pH范圍內(nèi)(pH3.0～11.0)氧化還原峰隨著pH值的增加負(fù)移,且形狀微有變化。但均可得到可逆､重現(xiàn)性良好的循環(huán)伏安圖(圖2)。
本實(shí)驗(yàn)測(cè)得酶中FeⅢ/FeⅡ電對(duì)的電位值比報(bào)道值(E=-0.50Vvs.SCE)正移,而且隨著表面活性劑所荷電荷由正到負(fù)而負(fù)移。原因是HRP分子外表面分布著許多帶電的氨基酸殘基,在中性pH條件下帶負(fù)電荷(等電點(diǎn)pI4.2)。所以荷正電的DDAB通過長(zhǎng)碳鏈的侵入和靜電作用,有利于HRP的活性中心與電極之間的電子交換,而且氧化還原電位隨[H+]的增加而正移。結(jié)果表明:(1)表面活性劑中長(zhǎng)碳鏈能侵入HRP分子中從而縮短電極與酶活性中心的電子轉(zhuǎn)移路徑。(2)在電極表面,酶的活性中心有良好的取向。(3)荷電的表面活性劑為酶的電子轉(zhuǎn)移過程提供特殊的微環(huán)境。
當(dāng)v<1V/s時(shí),電流與掃描速度無線性關(guān)系,ipc/ipa遠(yuǎn)離1,當(dāng)v<0.2V/s時(shí),陽極峰消失(圖3)。
這種現(xiàn)象表明有一受動(dòng)力學(xué)控制的電極反應(yīng)發(fā)生。原因是EPG電極表面的含氧基團(tuán)在較負(fù)電位下,產(chǎn)生超氧負(fù)離子自由基(O-2),而表面活性劑膜又增加了電極表面的憎水性,延長(zhǎng)了O-2存在的時(shí)間。其反應(yīng)歷程可表示如下:
3.2 辣根過氧化物酶催化還原H2O2
HRP催化還原H2O2過程可表示如下:
HRP(Fe2+)+H2O2 →化合物I+H2O
化合物Ⅰ+e-+H+→化合物Ⅱ
化合物Ⅱ+e-+H+→HRP(Fe2+)+H2O
在H2O2存在下,固定于電極表面的HRP(Fe2+)可以全部轉(zhuǎn)化為其氧化態(tài)化合物Ⅰ。而化合物Ⅰ能被直接或有媒介體幫助下,經(jīng)過中間過渡態(tài)化合物Ⅱ,還原為HRP (Fe2+)。無H2O2時(shí),只有酶中FeⅢ/FeⅡ的氧化還原峰。當(dāng)加入H2O2后, FeⅢ/FeⅡ電對(duì)峰消失,在-0.291V處,出現(xiàn)陰極峰,此峰表示了酶催化H2O2還原的過程(圖4)。
當(dāng)H2O2的濃度較低時(shí),峰電流的大小與H2O2的濃度呈線性關(guān)系(表2)。
隨著H2O2的濃度增加,峰電流不再按正比例增加,而是趨向極限值,其后峰電流反而降低。其結(jié)果與高濃度還原劑存在時(shí),HRP的活性降低是一致的。該電極置于PBS中保存在冰箱里(4℃),一周內(nèi)所測(cè)電流只下降7%。
4 結(jié) 論
表面活性劑膜為研究酶與電極之間的電子轉(zhuǎn)移提供了良好的微環(huán)境,為固定化酶從而制備生物傳感器提供了新的材料和手段。表面活性劑固定HRP于EPG電極表面,實(shí)現(xiàn)了直接電化學(xué),并對(duì)H2O2具有較強(qiáng)的催化活性,為構(gòu)造第三代生物傳感器,應(yīng)用于H2O2､葡萄糖､膽固醇的分析提供廣闊的應(yīng)用前景。
